K.R Biology🔬

🔶تخلیص DNA فاژ M13 مشکلات کمی دارد🧬

تفاوت بین چرخه آلودگی λ و M13، شکل دو رشته تکثیر شونده M13 است که مانند یک پلاسمید عمل می‌کند و با روش‌های استاندارد تهیه پلاسمید به راحتی تخلیص می‌شود. از سلول‌های آلوده شده با M13 عصاره سلولی تهیه شده و با استفاده از سانتریفیوژ، فاژ تکثیر و DNA آن جدا می‌گردد.

شکل تک رشته‌ای M13 بیشتر مورد نیاز است و مزیت آن نسبت به فاژ λ این است که میزان زیاد از M13 آسانتر بدست می‌آید. سلول‌های آلوده به طور مداوم ذرات فاژ M13 را به محیط ترشح کرده و با رشد سلول‌های آلوده، میزان فراوانی از M13 بدست می‌آید.

علاوه بر این با توجه به اینکه باکتری‌ها تخریب نمی‌شوند، آلودگی با بقایای سلولی وجود ندارد؛ در نتیجه سانتریفیوژی که برای تهیه فاژ λ لازم است، به ندرت برای M13 لازم می‌باشد.

به طور خلاصه، تهیه DNA تک رشته M13 مستلزم حجم کمی از کشت آلوده، سانتریفیوژ کردن جهت رسوبدهی باکتری‌ها، استخراج با فنل جهت حذف پوشش پروتئینی و رسوبدهی با اتانول برای تغلیظ DNA می‌باشد.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت بیستم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تهیه DNA باکتریوفاژ🧬

  تفاوت اصلی تخلیص DNA فاژ و تهیه DNA پلاسمید، در این است که تخلیص DNA فاژ نیازی به لیز سلولی ندارد چون در بیشتر موارد فاژ برای تکثیر، باکتری را لیز می‌کند و از آن خارج می‌شود. که به همین دلیل به میزان زیادی باکتریوفاژ در محیط خارج سلولی کشت باکتری آلوده وجود دارد. در این محیط با دور مناسب سانتریفیوژ، باکتری‌های سالم و تخریب شده رسوب کرده و ذرات فاژ معلق باقی می‌مانند.

  سپس ذرات فاژ جمع‌آوری شده و برای استخراج DNA، کپسید فاژ و پروتئین‌های محلول از باکتری حذف می‌شود.

  مجموع این فرآیند‌ها ساده‌تر از تهیه‌ی DNA پلاسمیدی یا تام سلولی‌ است. یکی از مشکلات تخلیص DNA فاژ به ویژه در مورد فاژ λ، رشد آن در محیط کشت آلوده است تا فاژهای خارج سلولی به اندازه کافی زیاد شود. میزان حداکثر مورد انتظار جهت فاژ λ 10¹⁰ ذره در هر میلی لیتر است. از این تعداد فقط 500ng از DNA بدست می‌آید. به همین دلیل برای بدست آوردن مقدار کافی از λ DNA حجم بیشتری از محیط کشت لازم است که هزینه‌هاب تولید را زیاد می‌کند.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت نوزدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶روش اول تخلیص DNA:
دناتوراسیون قلیایی🧬

در این روش، DNA غیرابرمارپیچ دناتوره شده اما پلاسمید ابرمارپیچ دناتوره نمی‌شود. اگر به عصاره‌ی سلولی هیدروکسید سدیم اضافه شده و PH در حدود ۱۲ - ۱۲/۵ تنظیم شود، پیوند‌های هیدروژنی DNA به جز پلاسمید‌های ابرمارپیچ شکسته می‌شود که باعث باز شدن مارپیچ دو رشته‌ای DNA می‌شود.

حال اگر اسید اضافه شود، DNA دناتوره شده و به شکل توده‌ای حجیم درمی‌آید که توسط سانتریفیوژ رسوب کرده و DNA پلاسمید در مایع رویی باقی می‌ماند.

یکی از مزیت‌های این روش، هزینه‌ی پایین بوده و مزیت دیگر این است که در برخی شرایط بسیاری از پروتئین‌های باکتری و RNA، با سانتریفیوژ جدا می‌شود. در نتیجه اگر از این روش استفاده شود، نیازه به تخلیص به روش کروماتوگرافی ستونی نیست.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت هجدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶جداسازی بر اساس ساختار فضایی🧬

  پلاسمید‌ها در سلول به دلیل خواص فیزیکی و بارهای الکتریکی DNA به صورت ابر مارپیچ هستند. مارپیچ دو رشته‌ای DNA پلاسمید در هنگام همانندسازی تا حدودی توسط آنزیم توپوایزومراز باز می‌شود و ابر مارپیچ را بوجود می‌آورد که این ساختار تا زمانی که دو رشته‌ی پلی نوکلئوتیدی دست نخورده باشد، باقی می‌ماند و به آن DNA حلقوی بسته کوالانسی (CCC) می‌گویند.

  از طریق عوامل فیزیکی یا شیمیایی، دو رشته پلی نوکلئوتیدی شکسته و به حالت استراحت بر می‌گردد که ساختار حلقوی باز (OC) نام دارد.

  ابر مارپیچ‌ها در مصارف کلون سازی و دستکاری‌های ژنتیکی اهمیت دارند و می‌توانند به راحتی از DNA غیر ابر مارپیچ جدا شوند. دو روش مختلف برای تهیه DNA پلاسمید از ابر مارپیچ به کار می‌رود که در هر دو DNA از عصاره‌ سلولی تخلیص می‌شود.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت هفدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تهیه DNA پلاسمید🧬

  یکی از روش‌های جداسازی پلاسمید، جدا کردن بر اساس اندازه است.

  اگر سلول را لیز کنیم، مقدار کمی از DNA شکسته می‌شود و هنوز قطعات بدست آمده بزرگتر از پلاسميد هستند که می‌توان با سانتریفیوژ آن‌ها را با بقایای سلولی جدا کرد. علت آن، اتصال کروموزوم‌های باکتری به غشا است که اگر این اتصال شکسته نشود، کروموزوم همراه با بقایای سلولی رسوب می‌کند.

  بنابراین خرد کردن سلول باید خیلی آرام و بدون توان‌های شدید صورت گیرد. برای جلوگیری از تجزیه‌ی سریع سلولی، مجاورت باکتری با لیزوزیم و EDTA در حضور سوکروز صورت می‌گیرد.

  در عوض اشکال اسفروپلاست ایجاد می‌شود (دیواره آن‌ها به صورت ناقص تجزيه شده اما غشای سلول باقی می‌ماند). در این صورت تجزیه‌ی سلولی، با اضافه کردن یک پاک کننده غیر یونی مثل تریتون X-100 انجام می‌شود. این روش موجب شکستگی کم کروموزوم شده و با سانتریفیوژ، عصاره‌ی شفافی باقی ‌می‌ماند که تقریبا به طور کامل دارای DNA پلاسمیدی است.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت شانزدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶اندازه‌گیری غلظت DNA🧬

با استفاده از طیف سنجی اشعه ماوراءبنفش (UV) می‌توان غلظت DNA را به دقت اندازه گرفت. چرا که مقدار UV که DNA جذب می‌کند با مقدار DNA محلول رابطه‌ی مستقیم دارد.
معمولا جذب در طول موج 260nm اندازه‌گیری می‌شود که در این طول موج هر یک واحد جذب A260 با ۵۰ میلی گرم DNA دو رشته‌ای در میلی لیتر برابری می‌کند.
می‌توان از میزان جذب UV، میزان خلوص DNA را نیز تعیین کرد. به طوری که در DNA خالص نسبت جذب در 260nm و 280nm برابر ۱/۸ بوده و نسبت‌های کمتر از ۱/۸، نشان‌ دهنده‌ی آلودگی با پروتئین یا فنل می‌باشد.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت پانزدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تغلیظ نمونه‌های DNA🧬
استخراج با مواد آلی، محلول بسیار غلیظی از DNA ایجاد میکند. روش‌های دیگر تخلیص معمولا محلول‌های رقیقی ایجاد می‌کند که باید غلظت DNA افزایش یابد.
متدوال‌ترین روش تغلیظ، رسوبدهی با اتانول است چون DNA در اتانول حل نمی‌شودو در حضور نمکی مانند یون +Na و دمای 20⁰C- اتانول موجب رسوب پلیمر‌های نوکلئیک اسید می‌شود. در نتیجه در محلول غلیظی از DNA و اتانول، DNA به صورت رشته‌هایی پلیمری شده در محیط اتانول شناور می‌گردد که اگر یک میله‌ی شیشه‌ای را به درون محلول DNA فرو کنیم، وقتی میله خارج می‌شود؛ مولکول‌های DNA به آن می‌چسبند و می‌توان به شکل رشته‌های فیبری شفاف از محلول خارج کرد.
اگر محلول DNA غلیظ نشد، پس از مخلوط شدن اتانول با DNA می‌توان آن را با سانتریفیوژ جدا کرد.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت چهاردهم
گردآوری توسط کسری راستی

#تغلیظ_DNA #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶۳. به کارگیری سیلیکا برای تخلیص DNA استخراج شده از سلول🧬

  مولکول DNA در حضور گوانیدیوم تیوسیانات به ذرات سیلیکا متصل می‌شود. در نتیجه برای تخلیص، در ستون کروماتوگرافی سیلیکا قرار داده شده و عصاره‌ی سلولی که حاوی گوانیدیوم تیوسیانات می‌باشد، از آن عبور داده می‌شود.
  مولکول DNA به سیلیکا متصل می‌شود و در ستون باقی می‌ماند در حالی که اجزای دیگر به سرعت خارج می‌شوند. بعد از شست و شو و حذف دیگر آلودگی‌ها، DNA با افزودن آب که باعث ناپایداری بر هم‌کنش DNA و سیلیکا می‌شود، بازیابی می‌شود.
  در مرحله‌ی اتصال DNA به سیلیکا، برای جمع‌آوری ذرات سیلیکا سانتریفیوژ می‌شود. سپس پِلِت برای آزاد کردن DNA در آب حل می‌شود. دومین سانتریفیوژ برای تشکیل پلت مجدد سیلیکا انجام می‌شود.
  یک روش دیگر استفاده از دانه‌های مغناطیسی پوشیده شده با سیلیکا است که به جای سانتریفیوژ، با آهن‌ربا در انتهای لوله جمع‌آوری می‌شوند. مزیت این روش سریعتر بودن و آسانی به دلیل اتومات بودن آن است.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت سیزدهم (قسمت سوم و نهایی)
گردآوری توسط کسری راستی

#تخلیص_DNA #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶۲. استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی جهت تخلیص DNA از عصاره سلولی🧬

یکی دیگر از روش‌های جداسازی اجزای مخلوط، کروماتوگرافی تعویض یونی است که بر اساس شدت چسبیدن اجزاء به ذرات باردار موجود در رزین، از یکدیگر جدا می‌شوند.
دو مولکول DNA و RNA مانند برخی پروتئین‌ها بار منفی داشته و به ذرات بار مثبت رزین متصل می‌شوند. با نمک می‌توان پیوند‌های الکتریکی را از بین برد. در نتیجه با افزایش تدریجی نمک، انواع مختلف مولکول را می‌توان از رزین جدا کرد.
رزین را در یک ستون پلاستیکی یا شیشه‌ای قرار داده و عصاره سلولی را از بالای ستون اضافه می‌کنند. به دلیل داشتن مقدار کمی نمک، تمام مولکول‌های دارای بار منفی به رزین متصل شده و در ستون باقی می‌ماند. با افزایش تدریجی نمک، به ترتیب پروتئین‌ها، RNA و DNA از ستون جدا می‌شوند و در شیشه‌ای جداگونه قرار می‌گیرند.
برای ادامه‌ی مراحل تخلیص DNA با همراه باشید.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت سیزدهم (قسمت دوم)
گردآوری توسط کسری راستی

#تخلیص_DNA #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

۱. جدا کردن آلودگی‌ها توسط عصاره مواد آلی و هضم آنزیمی
این روش شامل افزودن فنل یا مخلوط ۱:۱ فنل و کلروفرم است که موجب رسوب پروتئین‌ها می‌شوند اما نوکلئیک اسید‌ها محلول در آب باقی می‌مانند. در نتیجه با افزودن این محلول و سانتریفیوژ کردن، می‌توان پروتئین را به صورت لایه‌ای رسوبی و سفید رنگ بین لایه‌های آبی و آلی، جدا کرد. به طوری که پس از سانتریفیوژ محلول سه لایه می‌شود: لایه‌ی بالایی شامل نوکلئیک اسید‌ها، لایه‌ی میانی شامل پروتئین‌ها و لایه‌ی پایینی شامل فنل.
در برخی‌ عصاره‌ها، انقدر آلودگی پروتئین زیاد است که باید چندین بار استخراج با فنل صورت بگیرد اما اینکار ممکن است موجب خرد شدن مقداری از DNA شود، در نتیجه مطلوب نیست. در چنین شرایطی باید قبل از استخراج با فنل، با یک پروتئاز مثل پروناز یا پروتئیناز K تیمار شود تا پلی‌پپتید‌ها را به قطعات کوچکتر بشکند.
برخی RNAها مثل mRNA در تیمار با فنل جدا می‌شود اما اکثر آن‌ها باقی می‌مانند. باید از آنزیم ریبونوکلئاز جهت حذف سریع RNA استفاده کرد.
برای ادامه‌ی مراحل تخلیص DNA با همراه باشید.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت سیزدهم (قسمت اول)
گردآوری توسط کسری راستی

#تخلیص_DNA #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تخلیص DNA از عصاره سلولی🧬
عصاره سلولی باکتری علاوه بر DNA، مقادیر قابل توجهی پروتئین و RNA دارد. برخی از روش‌های تخلیص DNA از مخلوط عصاره سلول عبارت‌اند از:

۱. جدا کردن آلودگی‌ها توسط عصاره مواد آلی و هضم آنزیمی

۲. استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی جهت تخلیص DNA از عصاره سلولی

۳. به کارگیری سیلیکا برای تخلیص DNA استخراج شده از سلول

اگر هدف از کشت، تهیه‌ی DNA باشد، روش‌های شیمیایی متدوال‌تر است. اما در تولیدات صنعتی و استخراج پروتئین، از روش‌های فیزیکی بیشتر استفاده می‌شود.
لیز کننده‌های شیمیایی، به دیواره سلولی و غشا حمله می‌کنند. مثلا در مورد باکتری E.coli از لیزوزیم، اتیلن دی آمین تترا استات (EDTA) و یا ترکیب هر دو استفاده می‌شود. لیزوزیم آنزیمی است که پلیمری که موجب سخت شدن دیواره می‌شدد را هضم می‌کند. EDTA یون‌های منیزیم را خارج می‌کند که ساختار کلی پوشش سلول را حفظ می‌کردند. معمولا یک ماده‌ی پاک کننده مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) هم افزوده می‌گردد که با خارج کردن لیپید به لیز شدن کمک می‌کند.
در انتها، برای تهیه‌ی عصاره سلولی، اجزاء نامحلول به کمک سانتریفیوژ، ته‌نشین شده و عصاره سلولی در مایع شفاف رویی باقی می‌ماند.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت دوازدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#تهیه_عصاره #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تهیه عصاره سلول 🦠
برای آزاد کردن محتویات سلول باید غشای سیتوپلاسمی را شکست. این کار به دو روش صورت می‌گیرد:
۱. روش‌های فیزیکی
۲. روش‌های شیمیایی

برای رشد باکتری باید یک کلنی را از روی یک محیط جامد به محیط مایع انتقال داد و با اضافه کردن آنتی بیوتیک‌های مناسب که باکتری به آن مقاوم است، از رشد دیگر باکتری‌ها جلوگیری کرد. محیط کشت مایع، مخلوطی از مواد مغذی لازم برای رشد باکتری است.
دو نوع محیط کشت وجود دارد:
۱. محیط کشت معین ۲. محیط کشت نامعین

در محیط کشت معین تمام اجزا آن شناخته شده است مانند M9. دارای مخلوطی از عناصر ضروری مانند نیتروژن، منیزیم و کلسیم، و نیز گلوکز است. قبل از کاربرد M9، عوامل رشد افزودنی مانند ویتامین‌ها و عناصر کمیاب باید به آن اضافه گردد.

لوریا برتانی (LB) یک محیط کشت نامعین است چون اجزا و مقدار آن‌ها شناخته نشده‌اند. و دو ترکیب این محیط (تریپتون و عصاره مخمر) از نظر محتوای شیمیایی ناشناخته‌اند. تریپتون آمینواسید و پپتید‌های کوچک، عصاره مخمر نیتروژن، قند، مواد مغذی و معدنی را تامین می‌کند. محیط کشت نامعین به مواد افزودنی نیاز ندارد.
از محیط کشت معین، در موارد صنعتی یا کنترل شده‌ی رشد باکتری و از محیط کشت نامعین، صرفا در جهت تامین منبع DNA استفاده می‌شود.

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم         پارت یازدهم
گردآوری توسط کسری راستی

#total_DNA #خالص_سازی #کلون_سازی #cloning #براون #DNA #انستیتو_سنسوم  #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R

🔶تهیه DNA تام سلول🧬🧪

  ۱. باکتر‌ی‌ها کشت داده شده و آمایش (Harvest) می‌گردند.
  ۲. سلول‌ها شکسته و محتویات آن‌ها آزاد می‌شود.
  ۳. عصاره سلولی جهت جداسازی همه‌ی اجزا به جز DNA تیمار می‌گردد.
  ۴. محلول DNA بدست آمده تغلیظ می‌شود.

🔸خالص سازی DNA🧬🧪
اساس مهندسی ژنتیک DNA است و برای دستکاری و بررسی عملکری ژن‌ها یا کلون سازی، به روش‌های خالص سازی DNA نیاز است. یک مهندس ژنتیک حداقل نیاز به تهیه ۳ نوع DNA مختلف دارد:

۱. مولکول DNA تام سلول: منبع تهیه ژن‌ها جهت کلون‌سازی‌ است. ممکن است از کشت باکتری، گیاه، سلول‌های جانوری و ... تهیه گردد. شامل DNA ژنومی یک موجود با دیگر مولکول‌ها مانند پلاسمید می‌باشد.

۲. مولکول DNA پلاسمید: مورد نیاز جهت تخلیص، تهیه شده از محیط کشت باکتری، تفاوت با DNA تام، الزام به جدا و تفکیک DNA پلاسمید از توده اصلی DNA کروموزومی در برخی مراحل است.

۳. در صورت فاژ بودن ناقل، مولکول DNA فاژ: تهیه شده از ذرات باکتریوفاژی آزاد شده از سلول‌های آلوده و بدین ترتیب، فاقد مشکل آلودگی با DNA باکتری

کتاب کلون سازی ژن و آنالیز DNA : تی- اِ - براون ویراست هفتم پارت دهم
گردآوری توسط کسری راستی

#باکتریوفاژ #bacteriophage #phage #total_DNA #خالص_سازی #کلون_سازی #cloning #براون #DNA #انستیتو_سنسوم #کسری_راستی

آیدی کانال:
https://t.center/BiologyWithK_R